金銀花尺蠖幼蟲血細(xì)胞有何形態(tài)

　　Wright's-Giemsa的染色和光學(xué)顯微鏡觀察到了這一觀察結(jié)果。發(fā)現(xiàn)金銀花幼蟲的幼蟲的血細(xì)胞具有原始血細(xì)胞，漿細(xì)胞，顆粒血細(xì)胞，球狀血細(xì)胞和螨蟲，接下來小編簡單介紹一篇優(yōu)秀病蟲害論文。.

　　XIANG Yu-yong， ZHU Yuan-mei， YIN Pei-feng

　　(School of Biology and Food Engineering， Chuzhou University， Chuzhou 239012，Anhui，China)

　　Abstract： The larva hemocytes morphous of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu. was observed with Wright's-Giemsa's stain method and light microscopy technology. The results showed that there were 6 types of hemocytes in larva hemolymph of Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.including prohemocytes， plasmatocytes， granulocytes， spherulocytes， oenocytoids and cystocytes.

　　Key words： Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.; hemocytes;morphous observation

　　昆蟲是動物界中最大的類群，在長期進(jìn)化的過程中形成了一套復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，對入侵的病原體具有識別和清除能力，主要包括體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答[1，2]。血細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞免疫的主要執(zhí)行者，在抵抗病原體入侵的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用。昆蟲種類不同，參與細(xì)胞免疫的血細(xì)胞種類不同[3]，血細(xì)胞的某些生理機(jī)能變化常常表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)和組成的變化。因此，研究昆蟲血細(xì)胞形態(tài)分類對深入揭示其細(xì)胞免疫功能具有重要推動作用。自1669年Swammerdam首次發(fā)現(xiàn)昆蟲的“白”血細(xì)胞以來[4，5]，人們對昆蟲血細(xì)胞的研究已有 340多年的歷史，涉及蚊(Culicidae)、蠅(Muscidae)、 蚋(Simuliidae)、蜚蠊(Blattaria)、蠶(Bombyx mori)、粘蟲[Mythimna separata(Walker)]等100多種昆蟲[6，7]。由于昆蟲種類繁多，其血細(xì)胞形態(tài)各異，甚至同一種昆蟲不同蟲態(tài)、蟲齡在不同生態(tài)、生理條件下的血細(xì)胞形態(tài)也存在顯著差異。昆蟲血細(xì)胞的分類比較復(fù)雜，存在的分歧很多[8]。因此，應(yīng)對更多種類的昆蟲血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行研究，以豐富其形態(tài)分類。

　　金銀花尺蠖(Heterolocha jinyinhuaphaga Chu.)是近年來新發(fā)現(xiàn)的為害金銀花的食葉害蟲之一，該蟲為鱗翅目尺蛾科昆蟲，別名拱腰蟲，在安徽省1年發(fā)生3代[9]，常將葉片咬成缺刻或孔洞，危害嚴(yán)重的地塊金銀花葉片被全部吃光，僅剩葉脈和葉柄，常造成金銀花大面積減產(chǎn)，甚至成片死亡，給金銀花生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。目前，國內(nèi)對金銀花尺蠖的研究主要集中在生物學(xué)特性及防治方面[9-13]，對其血細(xì)胞的形態(tài)學(xué)研究尚未見報道。本研究對金銀花尺蠖幼蟲血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，以期為金銀花尺蠖幼蟲血細(xì)胞分類和細(xì)胞免疫研究提供試驗(yàn)依據(jù)， 同時也為金銀花尺蠖的防治提供新途徑。

　　1 材料與方法

　　1.1 供試?yán)ハx

　　從滁州市郊三界鎮(zhèn)野生金銀花上采集金銀花尺蠖幼蟲，帶回實(shí)驗(yàn)室于人工氣候箱(RXZ-288A型，寧波江南儀器制造廠)中用新鮮的金銀花葉片飼養(yǎng)多代，選取老熟幼蟲備用。人工氣候箱光周期(L∶D)為14 h∶10 h，溫度為(25±1) ℃，相對濕度為(70±7)%。

　　1.2 試劑

　　Wright’s染料(Sigma公司)、Giemsa染料(德國AppliChem公司)、磷酸二氫鉀(廣東西隴化工股份有限公司)、磷酸氫二鈉(廣東西隴化工股份有限公司)、甘油(無錫市晶科化工有限公司)、甲醇(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 染液配制 Wright’s染液：稱取Wright’s染料粉末0.1 g放在研缽內(nèi)，加入60 mL甲醇充分研磨，使染料全部溶解，然后把溶解的染料倒入干凈的棕色玻璃瓶中，在室溫條件下密封保存，7 d后即可使用。

　　Giemsa染液：稱取Giemsa粉0.75 g放入研缽中， 加入50 mL甘油， 研磨后置于58 ℃水浴中攪拌加熱90 min，溶入50 mL甲醇中，搖勻后置于37 ℃恒溫箱內(nèi)保溫8～12 h，過濾后置于棕色瓶中密封保存，即為Giemsa原液，12 h后即可使用。臨用時，取1 mL Giemsa原液與10 mL PBS(pH 6.8)混合。

　　1.3.2 配制1/15 mol/L磷酸緩沖液(PBS)

　　pH 6.8：稱取磷酸氫二鈉0.47 g，磷酸二氫鉀0.46 g，加入少量去離子水溶解，再定容至1 000 mL。

　　pH 7.2：稱取磷酸氫二鈉0.68 g，磷酸二氫鉀0.25 g，加入少量去離子水溶解，再定容至1 000 mL。

　　1.3.3 涂片與觀察 取金銀花尺蠖老熟幼蟲10頭，用無菌水清洗后擦干，用解剖針將其腹部刺破， 用移液器取少量血液，滴在載玻片上涂成血膜，先用Wright’s染液將血膜面充分覆蓋，稍等片刻再加Giemsa染液2～3滴，1 min后再緩慢地一滴一滴加磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)，直至膜面上染色液形成表面張力而終止加入。染色30 min后用自來水緩緩沖洗，涼干封片，在光學(xué)顯微鏡(BM2100型，南京江南永新光學(xué)有限公司)下觀察。

　　2 結(jié)果與分析

　　按照J(rèn)ones[14]的分類標(biāo)準(zhǔn)，通過光學(xué)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)金銀花尺蠖老熟幼蟲的血細(xì)胞包括原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞、類絳血胞和囊血胞6 種類型。這些血細(xì)胞在不同個體間形態(tài)與數(shù)量略有變化。

　　2.1 原血胞(Prohemocytes，PR)

　　原血胞也稱為原始血細(xì)胞，是數(shù)量較少的小型細(xì)胞，呈圓形或卵圓形，輪廓清晰，表面無突起，較光滑。細(xì)胞核為單核，紫紅色或紅色，位于細(xì)胞中央，比例很大，幾乎充滿整個細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)比較均勻，僅為薄薄的一層環(huán)繞在核周圍，無明顯顆粒狀物質(zhì)(圖1A)。一般認(rèn)為此類細(xì)胞為原始型，由造血器官或造血組織生成，可分化形成其他類型的血細(xì)胞，故名原血胞。

　　2.2 漿血胞(Plasmatocytes，PL)

　　漿血胞也稱為原生質(zhì)細(xì)胞，有球形、卵形、紡錘形、葉形及不規(guī)則形等多種形態(tài)，且大小不一。細(xì)胞核大，單核，位于細(xì)胞中央，約占細(xì)胞體積的一半。細(xì)胞質(zhì)均一，無顆粒內(nèi)含物(圖1 B、圖1C)。

　　2.3 粒血胞(Granulocytes，GR)

　　粒血胞是金銀花尺蠖幼蟲血淋巴中普遍存在的一種血細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下易于辨識，呈圓形、卵圓形或不規(guī)則形狀。細(xì)胞核多為圓形和卵圓形，位于細(xì)胞中央，約占細(xì)胞體積的一半。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含較大的異質(zhì)性溶酶體顆粒，據(jù)此可與漿血胞相區(qū)分(圖1D)。

　　2.4 珠血胞(Sphrulocytes，SP)

　　珠血胞多為大中型細(xì)胞，呈圓形，細(xì)胞內(nèi)有大小不同、數(shù)目不等的珠形內(nèi)含物圍成一圈，細(xì)胞核難以觀察到(圖1E)。

　　2.5 類絳血胞(Oenocytoids，OE)

　　類絳血胞是金銀花尺蠖幼蟲血淋巴中最大型的血細(xì)胞，細(xì)胞外形不規(guī)則，細(xì)胞核較小，呈圓形，位于細(xì)胞的一側(cè)， 有的有2 個核，細(xì)胞質(zhì)濃厚而均勻(圖1F)。

　　2.6 囊血胞(Cystocytes，CY)

　　囊血胞多為中型細(xì)胞，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞邊緣較光滑，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)具有大小不一的帶有折光性的顆粒或塊狀物(圖1 G)。

　　3 討論

　　昆蟲可產(chǎn)生多種類型的血細(xì)胞，通常可用形態(tài)、組織化學(xué)及功能特征來鑒別。血細(xì)胞的形態(tài)觀察是研究昆蟲細(xì)胞免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)，國內(nèi)的昆蟲學(xué)工作者對多種昆蟲血細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)了在不同種類的昆蟲中存在不同類型的血細(xì)胞，如劉玉濱等[15]利用掃描電鏡技術(shù)在華北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita Fald.)3齡幼蟲血淋巴內(nèi)識別出5種類型的血細(xì)胞，分別是原血胞、漿血胞、顆粒血胞、珠血胞和凝血胞;遲淑萍等[16]利用瑞氏染色法在德國小蠊(Blattella germanica)血淋巴中發(fā)現(xiàn)原血胞、漿血胞、顆粒血胞、珠血胞和類絳血胞5種類型的血細(xì)胞;王世貴等[17]利用姬姆薩染色和光學(xué)顯微鏡在紅褐斑腿蝗(Catantops pinguis)血淋巴中發(fā)現(xiàn)了原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞和囊血胞5種類型的血細(xì)胞;賈雷坡等[18]通過Wright’s染色和光學(xué)顯微鏡對不同地區(qū)東亞飛蝗[Locusta migratoria manilensis(Meyen)]的血細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗的血細(xì)胞包括原血胞、漿血胞、粒血胞及類絳血胞4種類型;晏容等[19]應(yīng)用姬姆薩染色結(jié)合相差顯微鏡及熒光染色方法在家蠅(Musca domestica)3齡幼蟲血淋巴中發(fā)現(xiàn)了原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞及類絳血胞5種類型的血細(xì)胞;魏麗芳等[20]應(yīng)用熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察識別出白蠟綿粉蚧(Phenacoccus fraxinus)血淋巴中有原血胞、漿血胞、粒血胞、類絳色血胞及囊血胞5種類型的血細(xì)胞。大量的研究表明，在鱗翅目昆蟲中有原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞及類絳色血胞5種類型的血細(xì)胞[21]，筆者對鱗翅目昆蟲金銀花尺蠖幼蟲血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)金銀花尺蠖幼蟲體內(nèi)存在原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞、類絳色血胞及囊血胞6種類型的血細(xì)胞，這一結(jié)果進(jìn)一步說明了不同種類的昆蟲在不同的生長期血細(xì)胞種類均有差異。還需進(jìn)一步對金銀花尺蠖其他蟲態(tài)和不同發(fā)育齡期的血細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察比較，從而更加準(zhǔn)確地鑒定血細(xì)胞的類型。

　　血細(xì)胞在昆蟲免疫中具有重要地位，通過各種血細(xì)胞與體液因子的協(xié)同作用，對侵入體內(nèi)的病原體及異物發(fā)生明顯的免疫防御反應(yīng)。不同的血細(xì)胞具有不同的功能，原血胞無吞噬功能，但具有活躍的分裂增殖能力，并可轉(zhuǎn)化為漿血胞，其主要功能為分裂補(bǔ)充血細(xì)胞，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為此類細(xì)胞為原始型，由造血器官或造血組織生成，其他各類血細(xì)胞多由其衍生;漿血胞的主要功能是吞噬異物，同時也參與包被和成瘤作用，是主要的防衛(wèi)血細(xì)胞，并可轉(zhuǎn)化為粒血胞;粒血胞的主要功能是貯存代謝，此外還參與防衛(wèi);珠血胞具有貯存和分泌作用，無吞噬功能;類絳血胞無吞噬功能，主要參與物質(zhì)代謝和分泌;囊血胞可能與昆蟲血淋巴的凝集和免疫有關(guān)[22，23]。

　　由于昆蟲的種類不同，對外來入侵物的細(xì)胞免疫反應(yīng)也不盡相同[8]，因此，還需深入研究金銀花尺蠖幼蟲的血細(xì)胞在免疫應(yīng)答中所起的作用，探討其血細(xì)胞免疫功能和作用機(jī)制，從而為金銀花尺蠖的防治提供理論指導(dǎo)。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1] LAVINE M D， STRAND M R. Insect hemocytes and their role in cellular immune responses[J]. Insect Biochem Mol. Biol 2002，32(10)：1237-1242.

　　[2] CERENIUS L，S?魻DERH?魧LL K. The prophenoloxidase-activating system in invertebrates[J]. Immunol Rev，2004，198(1)：116-126.

　　閱讀期刊：中國森林病蟲

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